众文网1.求胃癌细胞的western blot步骤,可以直接写在小论文上发表的简洁版
一.实验步骤1. 组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA）,PMSF（每克组织30μl,10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃4. 加入PMSF（每克组织30μl,10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃ 约20,000 g（约15,000转）15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2*电泳加样缓冲液9. 沸水浴中3分钟10. 上样11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色14. Westernblot 试剂盒显色15. 分析比较记录western blot的实验步骤及注意事项的资料1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。7.袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。
8.混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）9.用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。10. 将连接生物素的羊抗兔IgG(40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS)加在袋内，于室温下摇动1小时。
11.按步骤9洗涤。12.加入抗生素蛋白-HRP(40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS)，于室温下摇动。
注意事项：western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。
实验中取胶和膜需带手套。Western可以参考如下步骤进行操作。
1.收集蛋白样品（Protein sample preparation）可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
2. 电泳（Electrophoresis）(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
（2） 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白.（3） 上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。
电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。
SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的多功能电泳仪（带定时）。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90-120分钟。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3. 转膜（Transfer）我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜（NC膜）也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，。
2.westernblot的原理及操作步骤,应用有哪些
原理
Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗.经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变.以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分.该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达.
分类
Western Blot显色的方法主要有以下几种：i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL.只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带.
其他
值得一提的是，western blot 这个名称的由来很有意思.最开始做印迹工作的是一个叫做Southern的科学家，但印迹的对象是DNA链，他把这种技术称为Southern blot，后来类似的出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对RNA，一个对蛋白质，人们分别把这两种技术的称为Northern和Western，与这两个技术的发明人没有关系了.
3.SCI论文写作数据表的整理与表述主要体现在哪些方面
国际上，生物医学期刊都有统一的原则——整理成三线表，这是约定俗成的，非常清楚。
三线表由标目、线条和数据三部分组成。标目：横标目（transverseheading ）与纵标目（verticalheading ）。
横标目表7K研究的对 象和主要内容，如各组别；纵标目表示观察或测定的指标。 样本数U）在横标目与纵标 目之间。
标目中内容均不用复数形式。计量单位缩写放于指标之后或下面的括号内，数值的位数尽量精简，如过多，可改变计量单位，如l0000g改为l0kg。
线条：顶线（top line）、标目项（headingline，复杂表格可再内分）、底线（bottom line ） 共3条线，故名三线表。 数据：小数点后位数需要统一，以“ ± ”为中心对齐数据。
有统计差异的数据，用符号做标记，脚注中说明。缺失数据以“ND”表示。
图片资料整理——图像半定量与典型图片选取对于病理染色（光镜、电镜、激光共聚焦），以及Western blot（胶片红外或荧光成 像等）、Northern blot、蛋白质核酸电泳等图像成像，均需进行图像的半定量分析并统计。 值得医学家注意的是：（1 ）每个样本均需做病理，而后再每组挑选几个典型的代表性 的样本结果，不能做抽样。
以Western为例，如果一组有12只动物，12只都要做，而不 是每组选一个样本进行检测。表述的时候有几种表述，第一可以抽几个图片，再根据一 个胶的空数，可能15个空，一张胶就可以数出来，医学家做实验的时候就可以这么设计。
图片只定性是不够的，还要定量化的处理。举个例子：对于蛋白质的组学，做1个 定量样本，医学家要鉴定，3个样本全部都做出来，正常、模型、药物，医学家现在有所改进，两 种抗体在一张模上呈现，用现在的成像技术完全可以两种抗体在一张模上呈现，当然有 个先后顺序，这样结果非常可信。
（3 ）病理的常规的有HE染色，半定量分析之后，需做 1个柱状图进行结果的表述。如今，病理的定量化越来越多，尤其现在Image图像分析 技术，过去是半定量的，现在技术是一个很准确的定量技术。
比如流式细胞术可定量免疫或者生化实验的一些指标，细胞图像Images技术（活细胞工作站高内涵分析仪等） 可准确定量。 每一个细胞的每一种表达都进行一个精确的定量，现在一些国际上的药 物公司已经把它作为先导化的筛选和评价，能够多靶点、多成分、高通量地将中药的成 分给解析出来。
当医学家所在实验室条件有局限的时候，医学家对于这些图片资料也要符 合它的自身规律，还是要定性地、分级地分析，分级“+、++、+++、++++”后，进行见而分 析，将等级资料进行分析。 题外话谈一点SCI论文的标点符号，英文文章跟医学家平时的中文写作不一样的，国 际上是有要求的。
正确使用中文标点符号，严格区分半角与全角。中文必须是“全角”状态，每个标点占2个字符位。
英文必须是半角状态，没有中文的“、”等符号。该英 文句号占2个字符，其余占一个字符。
正确使用标点符号与正确书写引文是个基本规范问题D再就是引文格式，以温哥华的为准，也有其他的标准，比较方便的有Endnote等文献 管理软件。不同期刊，同一文献引文格式不一样。
在Endnote中能够搜索到相应期刊的 文献的格式（style ）。
4.SCI论文写作方法学应怎样整理
实验材料部分整理完，接下来是方法学（methods ）的整理。
方法学在材料和方法中占很大一部分，涉及实验研究所用的各种检测方法，尤其是一些重点研究方法都必须详 细论述。纵观各类SCI期刊，对于常见的实验方法，如Westernblot、PCR、病理HE染色等具有大致固定的表述方式，医学家可以根据自己的实验情况，套用这些模块，提高写作的 效率，进而可以建立自己写作的模板，并定期更新。
因为常用的经典的动物模型，以及相 应的检测方法基本上都是固定的，只不过每一次实验用的周龄、大小有点差异，动物委员 会给的动物的批号有差异。需要指出的是，方法学在用英文描述的时候都是用过去时 （past tense ），不用将来时（future tense ）也不用现在时（present tense ）。
实验设计（experimentaldesign） —般来说，基础研究有简单也有复杂。体外实验复 杂，要涉及一些功能性的分析，体内实验也复杂，因为涉及不同的剂量、疗程、不同的时间窗口等。
如果用文字讲非常啰嗦，也讲不清，就画一张技术路线图来表述，这样化繁为简，简便清楚。 同样的，在方法学部分，仍需要医学家建立模块。
不同的杂志对于方法学大同小异，可 以找出杂志近几期的文献看看，建立出自己的模板，这就是模块的写作。过去医学家老一辈留学生常有两个“做”，一个做饭，一个做胶（电泳分析）。
以做Western等定量定性研 究为例，这也是个复杂的过程，如何电泳、怎么转膜、怎么加一抗，用很简洁的文字，建立这么一个模块，对于医学家写作很有帮助。 接下来，数据整理的结果（results）部分，是整篇论文的核心。
结果部分的撰写，是对 原始资料进行二次、三次整理的一个过程。比如，做一个细胞增殖的体外实验，进行细胞 的同位素掺入，掺人以后，对第1~20个样本放射性的量进行测定，大概地进行分组，把数 据做一个统计分析，做一个简单的图，看下数据的趋势。
在投稿的时候，按照编辑的要求 进行格式上的修改。数据的二次整理非常重要，只有把无数个数据二次整理图拿到以后， 才能进行数据的归类、挑选。
资料二次整理后，对其进行表述。
5.如何成为学术论文写作高手
要想成为写作高手，要掌握以下的写作要点：
文章标题：
文章的标题，顾名思义是首先引起审稿人注意的地方，一个言简意赅，一语中的的标题，加上有吸引力及逻辑清晰的摘要这些因素都是决定文章命运的关键。文章的题目、摘要、图片，是审稿人首先要看的，如果第一眼就不满意，那么对文章的总体评价也不会太高，甚至会被直接P掉。
避免把写中文论文的风格带入SCI论文中，如中文论文标题中常常出现“初探”、“初步研究”等。也尽量不要出现novel、new等字眼。另外，许多题目喜欢用effect on。这类含糊的话，应该改为XXX促进或抑制XXX，这样更为明确的词语。
文章摘要：
摘要里尽量不要出现大量的数字，摘要的目的就是对整个研究内容的一个概述和精准的描述，要做到思路清晰便可，不要罗列大量的数字，在审稿人的眼中，摘要中的大量数字是不会对你的论文加分的，反而会很反感。
文章的图、表：
图与表的选择，能用图尽量用图表示，包括各种统计图。图更直观一些，表都是数字，很难理解的。如果一篇文章让reviewer看起来“难受”的话，结果不言而喻了。另外，近年来主张图尽量组合在一起，这样也容易理解一些。图表切忌模糊不清。在审稿阶段图表和正文一般是分开的，图和表都是一页一个，图还会被放大到A4纸的大小。这就要求图的质量要高，如果是矢量图那问题还不大，如果不是的话那分辨率一定要高，最好自己先放大打印出来看看。
参考文献：
参考文献及引用注重的是规范化，现在对于参考文献的规范使用一般是不成问题的，因为有很多的参考文献的管理软件可以使用，避免了手工制作耗时且容易出错的弊端。
章节标题：
章节标题的拼写一定要准确，另外小节，不建议用一个单词，而建议用一个短语或句子。经常看见的错误就是Conclusions,Acknowledgments不带s。这两个标题估计99%的人都要用到，而且孤零零就那么一个词，字号比一般的字还要大那么几倍，写错了话还真是着实扎眼。如实验结果一段，如western blot，有人在小标题就用western blot，让人不知道什么意思，这不是方法学一段。在结果中应该是XXX expression by western blot。这样会更清晰。
段落：
段落要细分，避免超长段落，这要考验作者的总结能力，尽量不要出现太长的段落。如果非常有必要将内容划到一个大的段落中，不妨适当使用enumerate和itemize，可以让文章看起来更简洁。
格式：
文章的格式要符合规则。一般来讲通篇双倍行距，段落之间留出空行，正文跟参考文献字体要区分开。此外，优秀的论文中数字1—12出现在文中时一般用text，数字也不做句子的开头，想必这些常识性的问题，大多数人是可以避免的。
在审稿人的眼中，优秀的SCI论文不仅仅体现在研究内容上，论文整体的思路以及规范化也是考量的重要标准，还有语言的表达能力，对语言进行了适当的论文润色是普遍认为十分必要的，所以一篇打动审稿人的优秀论文，考验着作者各方面的能力，看似艰难，不过通过不断的学习，锻炼，成功是必然的。
参考：查尔斯沃思论文润色贴士
转载请注明出处众文网 » westernblot毕业论文(求胃癌细胞的westernblot步骤,可以直接写在小论文上发表的简洁版)