1.分子生物学论文
字数可能有点超,你自己截取吧~~ 分子生物学(molecular biology) 在分子水平上研究生命现象的科学。
研究生物大分子(核酸、蛋白质)的结 构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。研究内容包括各种生命过程如光合作用、发育的分子机制、神经活动的机理、癌的发生等。
从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学。自20世纪50年代以来,分子生物学是生物学的前沿与生长点,其主要研究领域包括蛋白质体系、蛋白质-核酸体系 (中心是分子遗传学)和蛋白质-脂质体系(即生物膜)。
生物大分子,特别是蛋白质和核酸结构功能的研究,是分子生物学的基础。现代化学和物理学理论、技术和方法的应用推动了生物大分子结构功能的研究,从而出现了近30年来分子生物学的蓬勃发展。
分子生物学和生物化学及生物物理学关系十分密切,它们之间的主要区别在于:①生物化学和生物物理学是用化学的和物理学的方法研究在分子水平,细胞水平,整体水平乃至群体水平等不同层次上的生物学问题。而分子生物学则着重在分子(包括多分子体系)水平上研究生命活动的普遍规律;②在分子水平上,分子生物学着重研究的是大分子,主要是蛋白质,核酸,脂质体系以及部分多糖及其复合体系。
而一些小分子物质在生物体内的转化则属生物化学的范围;③分子生物学研究的主要目的是在分子水平上阐明整个生物界所共同具有的基本特征,即生命现象的本质;而研究某一特定生物体或某一种生物体内的某一特定器官的物理、化学现象或变化,则属于生物物理学或生物化学的范畴。 发展简史 结构分析和遗传物质的研究在分子生物学的发展中作出了重要的贡献。
结构分析的中心内容是通过阐明生物分子的三维结构来解释细胞的生理功能。1912年英国 W.H.布喇格和W.L.布喇格建立了X射线晶体学,成功地测定了一些相当复杂的分子以及蛋白质的结构。
以后布喇格的学生W.T.阿斯特伯里和J.D.贝尔纳又分别对毛发、肌肉等纤维蛋白以及胃蛋白酶、烟草花叶病毒等进行了初步的结构分析。他们的工作为后来生物大分子结晶学的形成和发展奠定了基础。
50年代是分子生物学作为一门独立的分支学科脱颖而出并迅速发展的年代。首先是在蛋白质结构分析方面,1951年L.C.波林等提出了 α-螺旋结构,描述了蛋白质分子中肽链的一种构象。
1955年F.桑格完成了胰岛素的氨基酸序列的测定。接着 J.C.肯德鲁和M.F.佩鲁茨在X射线分析中应用重原子同晶置换技术和计算机技术分别于1957和1959年阐明了鲸肌红蛋白和马血红蛋白的立体结构。
1965年中国科学家合成了有生物活性的胰岛素,首先实现了蛋白质的人工合成。 另一方面,M.德尔布吕克小组从1938年起选择噬菌体为对象开始探索基因之谜。
噬菌体感染寄主后半小时内就复制出几百个同样的子代噬菌体颗粒,因此是研究生物体自我复制的理想材料。1940年G.W.比德尔和E.L.塔特姆提出了“一个基因,一个酶”的假设,即基因的功能在于决定酶的结构,且一个基因仅决定一个酶的结构。
但在当时基因的本质并不清楚。1944年O.T.埃弗里等研究细菌中的转化现象,证明了DNA是遗传物质。
1953年J.D.沃森和F.H.C.克里克提出了DNA的双螺旋结构,开创了分子生物学的新纪元。在此基础上提出的中心法则,描述了遗传信息从基因到蛋白质结构的流动。
遗传密码的阐明则揭示了生物体内遗传信息的贮存方式。1961年F.雅各布和J.莫诺提出了操纵子的概念,解释了原核基因表达的调控。
到20世纪60年代中期,关于DNA自我复制和转录生成RNA的一般性质已基本清楚,基因的奥秘也随之而开始解开了。 仅仅30年左右的时间,分子生物学经历了从大胆的科学假说,到经过大量的实验研究,从而建立了本学科的理论基础。
进入70年代,由于重组DNA研究的突破,基因工程已经在实际应用中开花结果,根据人的意愿改造蛋白质结构的蛋白质工程也已经成为现实。 基本内容 蛋白质体系 蛋白质的结构单位是α-氨基酸。
常见的氨基酸共20种。它们以不同的顺序排列可以为生命世界提供天文数字的各种各样的蛋白质。
蛋白质分子结构的组织形式可分为 4个主要的层次。一级结构,也叫化学结构,是分子中氨基酸的排列顺序。
首尾相连的氨基酸通过氨基与羧基的缩合形成链状结构,称为肽链。肽链主链原子的局部空间排列为二级结构。
二级结构在空间的各种盘绕和卷曲为三级结构。有些蛋白质分子是由相同的或不同的亚单位组装成的,亚单位间的相互关系叫四级结构。
蛋白质的特殊性质和生理功能与其分子的特定结构有着密切的关系,这是形形色色的蛋白质所以能表现出丰富多彩的生命活动的分子基础。研究蛋白质的结构与功能的关系是分子生物学研究的一个重要内容。
随着结构分析技术的发展,现在已有几千个蛋白质的化学结构和几百个蛋白质的立体结构得到了阐明。70年代末以来,采用测定互补DNA顺序反推蛋白质化学结构的方法,不仅提高了分析效率,而且使一些氨基酸序列分析条件不易得到满足的蛋白质化学结构分析得以实现。
发现和鉴定具有新功能的蛋白质,仍是蛋白质研究的内容。例如与基因调控。
2.求一篇分子生物学的论文
分子生物学技术在国内防制虫媒传染病领域的应用 【摘要】 本文综述了国内近年来,分子生物学技术在虫媒病中蚊媒传染病防制的应用情况,以期为蚊媒传 染病的防制、应对突发公共卫生事件中蚊媒传染病的发生提供参考。
【关键词】 分子生物学技术;虫媒;传染病 虫媒病是由节肢动物携带病原体传播的一组疾病。1992年在国际虫媒病毒中心登记的已达535种,其中128 种对人有致病性[1]。
我国法定报告的传染病中,虫媒病占13种,蚊虫作为媒介,除了传播病毒性疾病外,还可传播 寄生虫病。这类疾病大都属于自然疫源性疾病,有一定的 地域性和时间性,发病率低、死亡率高,主要通过媒介的 控制进行防制[2]。
近年来,随着分子生物学技术的研究和 发展,在医学领域的应用日趋广泛,并取得了重大进展,作者就近年来分子生物学技术在蚊媒传染病的诊断和防制 等方面的应用综述如下。1 常用的分子生物学技术[3]1·1 核酸分子杂交技术 核酸的分子杂交(molecular hybridization)它是利用核 酸分子的碱基互补原则,在特定的条件下,双链解开成两 条单链,与异源的DNA或RNA (单链)复性,若异源 DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列,则在复 性时可形成杂交的核酸分子。
杂交的双方是待测核酸序列 及探针。核酸探针可用放射性核素、生物素或其它活性物 质标记。
根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探 针、寡核苷酸探针、RNA探针等。分类:根据被测定的对象,分为Southern杂交和 Northern杂交;根据所用的方法,分为斑点(dot)杂交、狭槽(slot)杂交和菌落原位杂交;根据环境条件:分为液 相杂交和固相杂交。
1·2 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR) 是以拟扩增的DNA分子为模板,以一对分别与模板互 补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照 半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合 成。通过不断重复这一过程,可以使目的DNA片段得到扩 增,同时新合成的DNA片段也可以作为模板,使DNA的 合成量呈指数型增长。
PCR各种应用模式:兼并引物( degenerate primer) pcr、套式引物(nested primer) pcr、复合pcr (multiplex pcr)、反向pcr ( inverse pcr或reverse pcr)、不对称pcr(asymmetric pcr)、标记pcr ( lp-pcr)和彩色pcr、加端 pcr、锚定pcr或固定pcr、玻片pcr、反转录pcr方法检测 rna、定量pcr。1·3 DNA芯片 基因芯片又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列(DNA microarray)。
是采用光导原位合成或显微印刷等方 法将大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相 应处理的载体上,然后加入标记的待测样品,进行多元杂 交,通过杂交信号的强弱及分布,来分析目的分子的有无、数量及序列,从而获得受检样品的遗传信。特点:具有通 量大,并行性、微量化与自动化等优点,但在实践中其研 究成本较高;方法标准化不足;配套软件不够完善。
2 分子生物学技术在虫媒病诊断的应用2·1 疟疾 黄炳成等[4]用pBF2 DNA片断,经标记后作探针,从 多种疟原虫DNA样本中检出恶性疟原虫。基因芯片在疟原 虫的研究内容还有疟原虫新基因发现[5]、转录因子调控网 络[6]、疟原虫适应人体宿主机制[7]、疟原虫比较基因组杂 交分析[8]、恶性疟原虫抗原变异分子机制[9]以及疟原虫攻 击红细胞机制[10]等。
2·2 丝虫病 黄志彪等[11]运用PCR技术检测血液中的班氏丝虫微 丝蚴,可检出lOOul阳性血样中的l条班氏丝虫微丝蚴;用 于检测班氏丝虫监测点540份血液样本结果均为阴性,镜 检血片结果亦为阴性。常规丝虫检测是在夜间采血,有资 料显示[12], SsP/PCR扩增系统可用于检测班氏丝虫病患 者血样中的循环DNA,能用于周期性或夜间周期性丝虫病 的日间血检工作,从根本上改变了丝虫病的诊断、监测和 工作方式。
2·3 登革热病 郑夔等[13]应用多重PCR技术快速鉴定4种血清型登 革病毒,并在同一反应管中进行多重PCR对登革病毒进行 分型鉴定,证实了2004年在广东发生的登革热疫情为I型 登革病毒;也有报道应用寡核苷酸芯片技术能同时确认流 感和登革热病毒[14]。长期受这种疾病困扰的地区将有望通 过这种技术的完善,获得有效的治疗和保护。
3.举例说明分子生物学在你所学研究领域的应用情况
1。分子生物学技术在中医药研究领域中的应用。分子生物学是从分子水平来研究生命现象的一门基础学科。把分子生物学的新技术引入到中医药研究中 ,不仅为阐释中医药理论、加深对疾病本质的认识、探讨中药的作用机理和研制新药提供了一种新的研究工具和手段 ,而且还将启迪新的思想和发展新的诊疗技术 ,并将对中医药学的变革和进步起到巨大的推动作用。
2。分子生物学方法在医学微生物中的应用。如用PCR检测致病菌。
3。分子生物学技术用于药理学研究的应用。分子生物学已成为现代生命科学的“共同语言”。其研究与发展,一方面不断把本学科的理论和技术引向深入,目前及今后相当长时期内,将在基因组、基因表达调控、结构分子生物学、信号转导等四大前沿研究领域中开展深入持久的工作,并以此开拓新的前沿领域和新的增长点;另一方面分子生物学不断地与其它学科进行广泛而深入的横向联系和交叉融合,以期使表现型和基因型的关系得到客观准确的阐释。当今,分子生物学、基因工程技术和神经科学作为生物医学中最具重要性和生命力的“三架马车”,将生物医学研究载入新的纪元,并为包括生药学在内的传统学科的发展与创新提供强大的驱动力。
4。分子生物学在心力衰竭研究领域中的应用。随着分子生物学技术的迅速发展,拓展了心力衰竭的研究空间。微小RNA(microRNA,mi RNA)芯片、小干扰RNA(smallinterference RNA,si RNA)、原位检测技术(如激光共聚焦技术)及蛋白质组学技术在心力衰竭中的研究进展以迅猛的趋势席卷生物研究的各个领域。
还有很多很多,随便举例都有很多。
4.急需关于分子生物学在动物技术上的应用的论文(要求很低)
关于分子生物学在动物技术上的应用的论文
写作是很痛苦的事情,你会遇到滞碍。这有很多原因,而且不一定能顺利解决。但是过于追求完美是一个很重要的原因。其实写作是一个不断完善的过程。当你发现所写的不是你开始想写的,写下粗稿,以后再修补。写粗稿可以理出自己的思想、渐渐进入状态。如果写不出全部内容,就写纲要,在容易写具体的内容时再补充。如果写不出来,就把想到的东西全部写出来,即使你觉得是垃圾。当你写出足够的内容,再编辑它们,转化成有意义的东西。
另一个原因是想把所有的东西都有序的写出来(in order)。你可能要从正文写起,最后在你知道你写的到底是什么的时候再写简介。写作是很痛苦的事情,有时候一天只能写上一页。追求完美也可能导致对已经完美的文章无休止的修改润饰。这不过是浪费时间罢了。把写作当作和人说话就行了。无休止的修改格式而不是内容也是常犯的错误。要避免这种情况。
从每一段到整个文章都应该把最引人入胜的东西放在前面。让读者容易看到你写的东西(Make it easy for the reader to find out what you've done)。注意处理摘要(carefully craft the abstract)。确定(be sure)说出了你的好思想是什么。确定你自己知道这个思想是什么,然后想想怎么用几句话写出来。大篇的摘要说明文章是写什么的,说明有一个想法但没有说到底是什么。不要大肆夸耀你自己做的事情。你经常会发现自己写的句子或者段落不好,但不知道怎么修补。这是因为你自己进入了死胡同。你必须回去重写。这会随着你的练习减少。确信你的文章真的有思想(ideas)。要说清楚为什么,不仅仅是怎么样。 为人而写,不要为了机器而写。不仅仅需要正确,还需要易读。读者应该只做最明显简单的推理。
完成文章以后,删除第一段或者前面的几句话。你会发现这些话其实对主旨没有影响。 如果你在所有的工作做完以后才开始写,就会失去很多好处(benefit)。一旦开始研究工作,好的方法是养成写不正式文章的习惯,每隔几个月(every few months)记下最新的和你刚学的东西。从你的研究笔记开始比较好。用两天时间来写,如果太长的话就说明你太追求完美了。这不是要进行判断的东西,而是与朋友共享的。在封面上说明“草稿”(DRAFT-NOT FOR CITATION)。拷贝很多份,给那些感兴趣的人看,包括导师。这种做法对以后写正式的论文很有好处。
5.分子生物学技术在动物营养学上的应用及其发展前景的论文
扫描版(部分文字乱码)分子生物学技术在动物营养学上的应用及其发展前景(上)摘要:本文从营养与基因表达调控、基因工程、转基因等三个方面综述了分子生物学技术在动物营养学中应用的最新进展,并对动物营养学的发展前景作了展望。
自从发现双螺旋结构以来,分子生物学取得了飞跃性的发展,形成了以基因工程为主要内容的的现代分子生物学技术@在生物学、医学等研究中得到广泛的应用,几乎渗透到生命科学的每一个领域,成为研究和揭示生命现象本质和规律的一种重要工具。当前,世界各国都将分子生物学纳入本国科技发展的重点,可以预见,"21世纪将是生命科学的世纪,全世界所共同面临的许多重大问题,诸如饥饿与营养、疾病、能源与环境污染等问题的根本解决,在很大程度上将依赖于分子生物学技术的发展和应用。
及时全面的了解和掌握分子生物学理论和技术的发展动态及研究热点,将具有重要的意义。就目前来看,我国动物营养学方面的研究工作基本尚处在机体水平:即在机体水平上研究各种营养素对机体的作用、在机体内的代谢与平衡、影响机体吸收营养素的因素等问题。
分子水平方面的研究还刚刚起步,尚处于初级阶段。动物机体的生理病理变化,如生长发育、新陈代谢、遗传变异、免疫与疾病等,就本质而言,都是动物基因的表达调控发生了改变的结果,许多生理现象的彻底阐明,最终需要在基因水平上进行解释,所以动物营养学的各方面研究应与分子生物学技术,尤其是基因工程技术相结合,从分子水平上来解释各种营养素对机体的作用机制、动物机体的生理病理变化等问题,这也是动物营养学今后发展的必然趋势之一。
*营养与基因的表达调控随着分子生物学技术不断发展,越来越多与代谢有关的动物基因被克隆和鉴定,人们对营养与基因调控的关系越来越感兴趣。营养与动物基因表达调控的研究已成为当今动物营养学研究的一个热点领域;如何通过改变日粮组成成分来调节体内相关基因的表达,从而使动物体处于最佳生长状况已成为现代动物营养学研究的重点;通过营养对动物基因表达的调控途径及其机制的研究,将为人们如何更加有效地对某些特定有益基因的表达提供理论依据。
已有大量证据表明,主要的营养物质如糖、脂肪酸、氨基酸以及一些微量元素(如锌)对动物体内许多基因的表达都有影响。!"!营养对磷酸烯醇式丙酮酸激酶基因表达的调控PEPCK是动物肝和肾中糖元异生作用的关键酶,目前较为研究清楚的是日粮中糖含量对PEPCK基因表达的调控。
糖类对PEPCK的调控主要是通过对其启动子的作用,当动物进食含有大量糖类的饲料时,PEPCK的启动了就会关闭,从而导致ABA8C水平大幅度下降,而当禁食或饲喂高蛋白质低糖的饲料时,PEPCK的启动子就会处于打开状态,从而PEPCK水平得到大幅度提高,其具体调控机制大致如下:?556D4(*0)#)等通过对大鼠ABA8C基因的分析表明,ABA8C基因启动子位于1 E+.至F#,之间,其中包含了大多数激素调控基因转录所必需的组织特异性调控元件。日粮中糖的含量水平会影响胰岛素、;?GA等激素的相对水平,而胰岛素与;?GA等激素相对水平又会影响到特异性!"#!转录因子的活性,特异性转录因子与$%$&'启动子上的相应调控元件结合与否,又会影响$%$&'基因的表达(,)。
现有大量证据表明,$%$&'基因一系列复杂的调控元件中,有包括胰岛素、甲状腺激素、糖皮质激素、视黄酸对$%$&'基因转录的正调控元件和胰岛素对$%$&'基因转录的负控调元件,在上述调控元件中,*+,$调控元件-&.%/和$(-0/调控元件是最重要的两种,*+,$对$%$&'基因的诱导和胰岛素对$%$&'基因的抑制作用就是通过这两个调控元件来进行调控的。因此,当进食含大量糖类的饲料时,由于*+,$水平的急剧下降以及胰岛素水平的急剧上升,从而抑制$%$&'基因的表达,导致肝中$%$&'水平大幅度下降,当禁食或饲喂高蛋白低糖的饲料时,则情况恰好相反。
!"#营养对脂肪酸合成酶($%&)基因表达的调控1+2是脂肪酸合成的主要限制酶,存在于脂肪、肝脏及肺等组织中,在动物体内起催化丙二酰&3+连续缩合成长链脂肪酸的反应,其活性高低将直接控制着体内脂肪合成的强弱,从而影响整个机体中脂肪的含量。有关营养与1+2基因的表达调控,2!4!&56789-:;;(/曾报道:糖类能诱导1+2基因的转录,而脂肪则抑制这种诱导的表达。
&3<=9等(:;;>)试验研究也表明,当给禁食后的成年鼠饲喂含高糖低脂肪的饲料时,1+2基因的表达就增强,而且相应的?.@+含量的增加幅度与碳水化合物的摄入量也成正比。糖类对1+2基因表达的影响。
为区分活体中激素水平变化的协同作用,13。
6.分子生物学的发展有何理论意义和实践意义
分子生物学的发展有何理论意义和实践意义实践应用意义在应用方面,生物膜能量转换原理的阐明,将有助于解决全球性的能源问题。
了解酶的催化原理就能更有针对性地进行酶的人工模拟,设计出化学工业上广泛使用的新催化剂,从而给化学工业带来一场革命。分子生物学在生物工程技术中也起了巨大的作用,1973年重组DNA技术的成功,为基因工程的发展铺平了道路。
80年代以来,已经采用基因工程技术,把高等动物的一些基因引入单细胞生物,用发酵方法生产干扰素、多种多肽激素和疫苗等。基因工程的进一步发展将为定向培育动、植物和微生物良种以及有效地控制和治疗一些人类遗传性疾病提供根本性的解决途径。
从基因调控的角度研究细胞癌变也已经取得不少进展。分子生物学将为人类最终征服癌症做出重要的贡献。
7.分子生物学在动物医学上的应用有哪些
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8.一个分子生物学硕士毕业论文的创新点怎么描述
一个分子生物学硕士毕业论文的创新点怎么描述
现在计算机操作系统及各种软件的运行都是按照一定的程序进行的,而人体的各种新陈代谢也是按照既定的各种程序进行的。而且,就现在来说,人类体内的调控系统,即人类自身具有的在亿万年进化中逐渐接近完美的程序,比起现在的计算机内的程序是有过之而无不及的。它具有更大的可调控性等优势。人类以后计算机的研制要借鉴生物自身具有的各种调控程序,而这种方面的研究也已经开始,如生物计算机,及对人体大脑的解密而正在研制的智能计算机。 相比之下,人类生物学的研究也离不开电子计算机技术的发展。例如现在生物学的发展已经进入分子生物学时代,而由于电子计算机技术的发展,很多生物科学研究方面的软件也应运而生,它极大地减少了科学家及生物公司技术工人的工作量,提高了效率,增加了收益。例如在基因工程中就会常用到很多生物软件,现简介一种: Omiga 2.0:主要功能:编辑、浏览、蛋白质或核酸序列,分析序列组成。用Clustal. W进行同源序列比较,发现同源区。实现了核酸序列与其互补链之间的转化,序列的拷贝、删 找核酸限制性酶切位点、基元(Motif)及开放阅读框(ORF),设计并评估PCR、测序引物。查找蛋白质解蛋白位点(Proteolytic Sites)、基元、二级结构等。查寻结果可以以图谱及表格的显示,表格设有多种分类显示形式。利用Mange快捷键,用户可以向限制性内切酶、蛋白质或核酸基元、开放阅读框及蛋白位点等数据库中添加或移去某些信息。每一数据库中都设有多种查寻参数,可供选择使用。用户也可以添加、编辑或自定义某些查寻参数。可从MacVectorTM、Wisconsin PackageTM等数据库中输入或输出序列。另外,该软件还提供了一个很有特色的类似于核酸限制酶分析的蛋白分析,对蛋白进行有关的多肽酶处理后产生多肽片段。 实际上,大部分对核酸蛋白的序列分析功能,在Omiga 2.0中都能找到;而且界面非常友好。Omiga作为强大的蛋白质、核酸分析软件,它还兼有引物设计的功能。 当然,Omiga还有很多同类软件。如日立软件公司(Hitachi Sofeware Engineering Co.,Ltd.)97年推出的DNASIS 2.5,加拿大的Premier公司开发的Primer Premier 5.0等。 发展前景 : 生物软件具有很有的兼容性,可以支持现在的操作系统。 生物软件、芯片具有专利性,是典型的知识经济时代的产物。具有专利性的物品,出卖的是智力,是现在具有知识武装的大学生创业的重要方面。 我们来看一组关于生物软件产品的售价: 基因芯片综合分析软件ArrayVision 7.0 :售价6900美元 供应BI-2000医学图像分析系统 48000元(人民币)/套 显微镜自动平台系统 5800元(人民币)/套 Paup 一种功能强大的商业版系统进化分析软件,价值数千美金。 由此我们可以看出生物软件是一个相当大的产业,新的产业造就新的财富,新的财富将由新人来获得,而具有生物与电子计算机技术的新一代大学生,无疑将充当这群去创造新财富的新人。 意义及作用 : 当今世界,国与国之间的竞争,不仅是军事实力的竞争,更是综合国力的竞争。而科学技术的竞争在当今日益知识化信息化的世界显得尤为重要,因而也就成为综合国力竞争中极其重要的方面。生物科学作为现今最热门及将来最有前途的科学,其重要性更是不言而喻。再有,现代社会中,电子计算机已经逐渐占据了主流地位。所以,生物与计算机的融合是时代的必然。而生物软件就是这两者最直接的结合。所以,生物软件的发展程度是一个国家综合国力的体现,谁如果在这方面领先于世界,那必将引领时代的潮流。反之,谁如果在这方面掉以轻心,将来必受制于人。 在当今世界日益重视身体健康的情景下,生物与计算机的结合必将造福人类。 由此观之,生物软件的发展是时代的趋势,而我们这一代,将是这趋势的创造者。我们大有前途。
9.求论文:病毒中核算在分子生物学中的应用
【综述】几种用于发现未知病毒核酸序列的技术及其应用翁康生 病毒是引发人类传染性疾病的主要病原体之一, 它们极大地威胁着人类健康。
目前还存在人类尚未认知或新出现的病毒, 随时可能严重危害人类健康安全〔1 - 3〕。及早地发现,鉴别未知的或新出现的病毒, 是有效的预防和控制的先决条件之一。
因此, 建立、储备、改良、发展、乃至创新应用于发现、鉴别未知或新出现病毒的技术方法是十分必要的。近20 多年来, 常采用传统的微生物学技术方法和现代分子生物学技术方法相结合的途径, 发现和鉴别未知病毒。
通过细胞培养的方法分离病毒、电镜观察、用已知病毒的抗血清建立的免疫学方法作排他性检测、用已知病毒核酸序列建立的PCR、杂交等方法, 作特异核酸序列的检测、用分子生物学技术获得未知病毒核酸序列, 查询基因数据库, 检出并确定未知病毒基因组序列, 最终发现鉴别出未知病毒。对于无法用细胞分离培养的未知病毒, 有的采用免疫学与分子生物学技术相结合, 筛选获取病毒特异抗原编码基因的克隆, 进而发现鉴别出该病毒。
更多的则是采用相应的分子生物学技术, 从被检样品中发现获取未知病毒的核酸序列,进而发现鉴别未知病毒。无论未知病毒是否可以用细胞培养分离, 最终对其基因组序列的测定分析, 是鉴别和判断的决定性依据之一, 而获取未知病毒的核酸序列是前提条件。
从少量样品中, 从高度复杂的宿主细胞核酸物质中, 分离、扩增、获取足够量的无基因序列资料的未知病毒的核酸片段, 供进一步克隆、测序、生物信息学分析, 是用分子生物学技术发现、鉴别未知和新出现病毒的关键之一〔4〕, 也是最终测定分析, 拼接出未知和新出现病毒基因组序列的瓶颈步骤。病毒所携核酸物质有DNA 和RNA 之分, 可采用的技术方法也有所不同, 现将有关技术与其应用作一简介, 以供参考。
1 代表性差异分析法代表性差异分析法是为寻找分析两个生物样品复杂的基因组间有何差异而发展建立起来的分子生物学技术方法, 并不断得到演化, 发展和应用。病毒感染宿主细胞后, 与未感染的同类细胞相比, 二者核酸物质间的差异主要在于是否存在病毒核酸。
消减去二者核酸间相同序列的背景部分, 扩增、比较、选取余下可能存在差异的部分, 进一步分析以发现未知病毒的核酸序列。病毒的核酸结构各有不同, 可选用相应的代表性差异分析法, 见表1 。
111 DNA 代表性差异分析法(DNA Representation differenceanalysis , DNA RDA)此方法是Lisitsyn 等〔5〕利用核酸消减杂交技术〔6〕、PCR 方法和双链DNA 热变性后互补链退火复性的二级动力学原理〔7 - 8〕作者单位:上海市疾病预防控制中心 200336表1 病毒核酸类型与各代表性差异分析法的选用病毒核酸类型DNA RDA c DNA RDA非rRNA 序列6 核苷酸引导c DNA RDAds DNA 线状√ds DNA 环状√ss RNA polyA( + ) √ss RNA polyA( - ) 3 √ds RNA polyA( - ) √ 3 负链ss RNA polyA( - ) 视病毒在宿主细胞的转录机制而定。而建立的。
方法中将需分析的样品DNA(Test DNA ,T- DNA) 和对照DNA(Driver DNA ,D - DNA) 设为二组,分别用同一种限制性内切酶酶切处理,并接上5′端去磷酸化的人工接头,补齐接头后,加入与接头序列互补的引物作PCR 扩增。切除扩增产物上的人工接头后,切出的T - DNA 连上第二种人工接头,变性后与过量的变性D - DNA 杂交。
通过杂交,消减去T- DNA 中与D - DNA 中同源的核酸序列,而只存在于T - DNA 中的靶序列DNA(Target DNA) 则自我退火复性,其两端连有第二种人工接头。加入与第二种接头互补的引物作PCR ,只有靶序列DNA呈指数扩增,因而得到进一步富集。
进过如此重复的几个轮回后,以电泳检测比较T- DNA 和D - DNA ,将T- DNA 中呈现的差异部分作分离,克隆,序列分析。Lisitsyn 等以10μg 人淋巴细胞基因组DNA 作为D - DNA ,在相同的人DNA 中加入相当于单拷贝量的120 pg 腺病毒DNA作T- DNA。
以此作为实验模型,用DNA 代表性差异分析法成功的寻找、鉴定出外加入的腺病毒DNA 序列。应用此技术,Chang 等〔9〕在艾滋病相关的卡波西肉瘤(Kaposis Sarcoma) 中发现一段类似人类疱疹病毒的基因, 并由此发现一种新的病毒HPV8。
以后人们又以此技术发现鉴定了HPV6、TTV 病毒、黄热病毒样基因组、MDV 等〔10 - 13〕DNA 病毒。112 cDNA 代表性差异分析法(cDNA Representation differenceanalysis , cDNA RDA)Hubank 等〔14〕针对mRNA 所含序列相对简单的特点,提出了cDNA 代表性差异分析法。
它的基本原理与DNA RDA 相同,主要不同在于,采用识别4 核苷酸序列的限制性内切酶,它的识别位点在mRNA 反转录成的cDNA 中出现的频率更高,平均酶切片段长度约256 bp ,保证了cDNA 序列群中绝大多数序列,至少被切出一个片段可扩增,供差异分析,分离鉴定。cDNA RDA 技术相对经济,可高效灵敏地用于非常少的起始材料而获得结果〔15〕。
具有polyA( + ) - RNA 病毒,其核酸可类似于mRNA 分离纯化,因此可应用此技术。利用cDNA RDA技术,发现鉴定了TiV、MenV ,等〔16 ,17〕。
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