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改良碱性磷酸酶染色法
[日期：2008-08-11] 来源： 作者：乔海兵，邢开宇
【关键词】 碱性磷酸酶染色法
1939年Gomori首次提出碱性磷酸酶组织化学染色法用于哺乳动物神经系统血管内皮，1951年Gomori修改了自已的 方法 ，并称为“钙钴法”。1984年Bell在Gomori碱性磷酸酶染色法的基础上进行了改良，用于人脑海马和距状裂区的毛细血管取得成功〔1〕。本文以Bell法为基础，对其法的某些步骤进行了简化和改良， 应用 于脑微血管的 研究 ，同时可以显示出脑微动脉、微静脉。现将此法介绍如下。
1 原理
此方法为金属阳离子沉淀法。以β甘油磷酸钠为底物，在酶的作用下，产生磷酸离子与钙离子形成磷酸钙为第一反应产物。经硝酸铅处理变为磷酸铅沉淀，为第二反应产物。两种反应产物均易解离，进一步用稀硫化铵处理，形成稳定的硫化铅颗粒，沉淀于微血管内皮中，光镜下呈黑色〔2〕。
2 方法
2.1 取材
标本在24 h内取出，切成2 cm*2 cm*2 cm的组织块，放入4 ℃冰箱中保存。尽快放入固定液中固定24 h以上。
新鲜固定液的配制：无水氯化钙 5 g；巴比妥纳 2.5 g；纯甲醛液 5 ml；蒸馏水 488 ml。
2.2 脱水
组织固定好之后，移入70%的酒精24 h，依次移入85%酒精4 h，无水酒精，丙酮（1∶1）溶液4 h，无水酒精，乙醚（1∶1）溶液中4 h。
2.3 包埋
将脱水之后的组织块修整，移入5%的火棉胶溶液中浸泡包埋，放入4 ℃冰箱中，1周后可成块。
2.4 切片
切片厚度在60 μm左右，置入75%酒精中。
2.5 孵化
将切片放入孵化液中，在37 ℃恒温箱内孵化2 h~4 h。孵化液的配制：β甘油磷酸钠1.2 g；无水氯化钙1.96 g；巴比妥钠1 g；蒸馏水200 ml。
2.6 染色
将孵化好的切片快速更换3次蒸馏水，马上置入1.5%硝酸铅溶液中5 min，快速更换3次蒸馏水，然后放入2%硫化铵溶液中3 min，再快速更换3次蒸馏水。
2.7 裱片、脱水、封片
裱片后脱水，二甲苯透明封片。
3 改良措施
取材要新鲜，以免降低血管内皮碱性磷酸酶的活性。固定液和孵化液配好之后，可不调其pH值，只需用pH试纸测试固定液呈弱酸性，孵化液呈弱酸性即可。包埋过程中 应用 梯度包埋法，火棉胶浓度最高不能超过10%。先将组织块放入5%的火棉胶溶液中，留一小开口，置入4 ℃冰箱中，以利于酒精挥发，每天给容器加满火棉胶。2 d~3 d后改换10%的火棉胶，直至包埋好为止。包埋好的组织块应硬度适宜，用手指轻按可留有指纹，但不易碎。孵化过程适当延长，以利于内皮细胞碱性磷酸酶与孵化液充分反应。在裱片过程中由于切片较厚，切片很容易脱落。可采用先透明后封片的办法，既不 影响 切片的透明度，片子也不容易脱落。
4 讨论
碱性磷酸酶染色属于组化呈色法，由于此法对微血管显色均匀、充分，并可较好的反映正常微血管的 自然 扩张状态，有效地避免了血管灌注法的种种缺憾，而且此法经多次改良，使操作 方法 更为简单，呈色时间缩短，因而成为 目前 较为流行的一种微血管形态学的 研究 方法〔3〕。但Hunzlker等认为，由于小静脉内皮细胞碱性磷酸酶分布不集中，活性较低，因而微静脉难以显示。我们在研究过程中对碱性磷酸酶法进一步改良之后，可显示大量的带有三角形膨大的血管（见图1），而这一特点正是微静脉所特有的，所以我们认为，并非微静脉用此法不能显示，而是在实验过程中pH值、温度掌握不准所致。
参考 文献 ：
〔1〕王有伟，陈以慈.碱性磷酸酶染色法（钙铅法）在研究人脑和心脏微血管方面的应用〔J〕.解剖学杂志，9(3):227.
〔2〕杜卓民.实用组织学技术〔M〕.北京：人民卫生版社，1982:309.
〔3〕张为龙.脑血管研究近况〔J〕.临床解剖学杂志，1986,4:118.
2.谁有酶制剂的相关资料,急需写毕业论文用
文章内容：摘要介绍了目前国际上酶制剂的市场和发展情况，叙述了我国酶制荆的生产和应用与国际先进水平相比有报大的差距，提出了今后发展的建议关词.曼，苎！塑垦，塞曼三些饲料工业.酶制荆工业是生物工程的重要组成部分，由于它的催化效率比化学催化荆高千百倍，因此受到人们的广泛重视.应用范围越来越宽，杜会效益更加显着.酶制荆最初从动物脏器和高等植物种子，果实中提取，随着科学的进步和酶的应用工业的发展，不仅从动物中提取酶制剂（如胰酵，木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，植物口一淀粉酶），而且从微生物中筛选各类菌种，适应各种工业用途的需要.从国际上来看.酶翻剂工业的最大市场在美国和欧共体.其次是日本.根据近几年了解到的信息，世界上发达国家的酶翻剂工厂约70家.其中规模较大的25家，排前8名的有：（1）丹麦（2）荷兰一（工业酶部分并人美国杰能科国际有限公司）（3）芬兰（4）美国（5）比利时-/（6）丹麦1日∞（7）法国（8）荷兰据报导，19昭年世界醇制荆产量6.5万吨.销售额4亿美元；1991年世界工业酶制剂产量约0万吨.销售额6.1亿美元：1992年为6.4亿美元；1993年销售额为0亿美元；1994年销售额为亿美元.今后几年酶翻剂将以7~8%的速度增长.公司是世界上工业酶制剂和胰岛素最大生产厂.在世界上丹麦，日本，美国，巴西，中国等七个国家建有工厂，在5多个国家设有办事机构.每年投人科研开发经费高达1.5亿美元.占公司销售收人的12.5%.有三分之一职工从事科研开发和应用开发.我国自1'65年建立第一个专业化酶翻剂工厂以来.由于国家的重视和1979年组织了行业协作组和1992年成立了中国发酵工业协会酶翻荆分会，加强了行业管理和科技交流，使酶翻荆工业得到了迅速发展.特别是改革开放以来.通过内部联台和引进国外技术，酶铷荆的产品产量，质量，技术水平都有不同程度的提高，嫡短了与国外先进水平的差距，在应用工作上也大大向前推进一步下面就三方面谈谈我的认识：一酶制剂工业发展迅速（一）醉制荆产量成倍增长毫1十年扮朔年]985拄1990越]995越历年酶镧荆8.篮2477.098585.79篮293总产量/品种淀粉酶产量26818743啦.，067673400（吨）糖化酶产量790935365衄6.234∞00（吨）？5？从袁1中看出.淀粉酶1985年产量比1卿年产量增长63.4%;19帅年产量比1985年产量增长676%;1995年比19帅年增长三倍以上.5年淀粉酶产量增长0倍.糖化酶1985年产量比198年产量增长6.5倍；19帅年比95年增长2.7倍1995年比19帅年增长1.8倍.5年糖化酶产量增长7倍.其增长速度远远超出预定计划.（：）产品品种不断增加965年时酶制剂总产量只有0.盟吨，生产一淀粉酶一个品种，966年以后增加生产和398中性蛋白酶，产量为26.81吨.1979年研制成功糖化酶新菌种，在垒国酿酒行业普遍推广.对节约粮食，减轻劳动强度起了很大作用.从表可以看出，1980年至1985年五年问.糖化酶的产量增长6.5倍超。
3.有关酶本质的探究的生物论文300字左右
1926年美国科学家J.Sumner从刀豆种子中提取了脲酶的结晶，并且通过化学实验证实了脲酶是一种蛋白质。
J.Sumner因此荣获了1964年的诺贝尔化学奖。在此后的几十年中，人们所发现的几千种酶都是蛋白质，所以20世纪30年代，科学家对酶定义为：酶是一类具有生物催化作用的蛋白质。
有的酶为单纯蛋白质，其分子组成全为蛋白质，不含非蛋白质物质，如大多数水解酶类；有的酶为缀合蛋白质（结合蛋白质），其分子中除蛋白质外，还有非蛋白质物质，如氧化还原酶类。结合蛋白酶的蛋白质部分成为酶蛋白，非蛋白质部分成为辅酶或辅基，酶蛋白和辅基组成的完整分子成全酶。
只有全酶方起催化作用，分开后的酶蛋白或辅酶皆无催化作用。有些辅酶和酶蛋白结合紧密，不易分开；有的辅酶和酶蛋白结合疏松，前者一般称为辅基，后者一般称为辅酶。
辅酶是指直接参与催化反应中的有机物。按照近代意义，游离金属离子，如Mg2+﹑Mn2+等，不能称为辅酶，只能称为辅助因子，因为金属离子只是间接参与催化，有的仅仅是维持酶分子的——SH基的还原状态；有的只是帮助形成活性必需的立体构想。
辅酶相同而酶蛋白不同的几种酶能催化同一种化学反应，但各作用于不同的底物。例如乳酸脱氢酶与苹果酸脱氢酶有同样的辅酶（NAD），但酶蛋白不同，它们虽然同样催化脱氢作用，但前者只能催化乳酸脱氢，而后者只能催化苹果酸脱氢。
4.求一篇有关酶类的生化小论文
生化酶类项目室内及室间质控评价与分析
目前，随着《医疗事故处理条例》举证颠倒的需要，医学检验质量控制工作显得尤其重要，检验质量的科学治理受到广泛重视。我科在做好室内质控的同时，参加了历年来生化室间质控活动。本文主要对我科生化酶类项目室内、室间质控结果进行了评价和分析。
1 材料、方法及项目
1.1 质控血清 室内进口液体质控血清BackmanLevel 1(L1)和Level 3(L3)两个浓度水平，由金坛试剂站提供。室间质控血清由省临检中心提供。
1.2 试剂、仪器及方法学分类 使用上海复旦张江公司的酶类生化试剂，并在岛津CL-7200全自动生化分析仪上按使用说明优化编程测定。
1.3 测定时间、方式 2个批号的室内质控血清天天上午随机顺序上机丈量，天天丈量一次。室间质控血清按临床中心要求进行。酶类项目反应温度是37℃ ，每月均对结果进行统计处理，并在每季度28日前寄回省临床中心。我室对22项进行了测定评价，其中酶类项目7项，分别是ALT、AST、ALP、GGT 、CK 、LDH—L、AM Y。
1.4 评价方式 靶值；标准差（S）；变异系数（CV）；均匀误差；组内室间质评靶值，标准差，变异系数。
2 结果
7种酶类项Et室内质控评价结果见表1，室间质控评价见表2，均匀误差见表3。室内质评7种酶类项目S、RCV均小于组内相同条件实验室均匀水平，室间质评按PT评价方案均符合，各项得分均为100分。
3 讨论
近年来，随着省临检中心同一订购室内质控品，我科完善了室内质量控制制度，并对工作职员进行了质控专题培训，为进步生化检验质量建立了良好的基础。采用了室内质控CV和室间质控cV同步评价方式，及时了解和把握了我科结果正确与否以及在全省质量控制活动中出现的题目，查找和分析结果出现误差的原因，寻求解决的方法，进步了我科生化质量治理水平。室内质控两个批号血清的均匀值，从表3统计来看，我室ALT、AST、ALP、CK、AMY 质控血清L1均匀误差为0.25,GGT均匀误差为0.50，室间质控各项结果在0.02-- 0.09之间。分析原因可能由于仪器试剂冷躲室故障使试剂质量受到影响，同时省中心质控尚有特殊对待可能。
通过使用“同一”浓度质控物做室内质控，使得各参评单位有了一个相对恒定的“标准”，可利用“中心”的反馈信息，经常性校对本实验室的测定结果，以求得与其他实验室结果的一致。可见使用全省相同浓度的质控血清且认真测定，按时回报室内质控结果，对进步室间质评成绩的意义很大。
5.影响酶活性的因素论文
酶是一种活性蛋白质。
因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。
（一） 温 度 大曲和麸曲的酶活性，在低温干燥的条件下，可以得到良好的保存。酶的催化作用，只有在一定温度下才能表现出来。
酶的作用速度与温度的关系为：当酶蛋白没有因受热而变性时，温度每升高10℃，反应速度增加一倍左右[13]。通常酶的作用速度随温度升高而加速，但温度升高到一定限度后，酶的活性就要钝化，直至完全失活。
在酿酒生产中，酶作用的最适温度，应根据生产日的不同而选择。例如，在制备米曲汁糖液时，要求尽快糖化，其最适温度可控制在55—60℃；如用于白酒发酵，发酵期可长达4—5天乃至数月。
酿酒中为保持酶活性作用的持久，必须坚持低温入池，低温发酵醇。 （二） pH值 pH值可改变底物的带电状态，从而影响底物分子与酶的结合。
各种酶的特异性表明，酶的活动中心只能结合带某种电荷的离子，包括正电、负电或两性电荷。例如，胃蛋白酶只作用蛋白质的正电离子；胰蛋白酶只作用蛋白质的负电离子；而木瓜蛋白酶只作用蛋白质的两性离子，所以，木瓜蛋白酶最适pH值和它的等电点相同，pH值为5—6。
酶分子具有两性电解质的性质，同时pH值也改变了酶分子的带电状态，特别是改变了酶活力中心上有关基团的电离状态。当在某一pH时，酶分子的活动中心，既存在一个带正电的基团，又存在一个带负电的基团，这时，酶与底物结合最容易；当pH偏高或偏低时，其活动中心只带有一种电荷，就会使酶与底物的结合能力降低。
例如，蔗糖酶当处于等电点时，才具有酶活性，而在等电点的偏酸或偏碱的一侧，酶活性则降低甚至完全丧失。又如，糖化酶作用的最适pH值在4.5左右，这个最适pH值即为该酶的等电点，高于或低于这个pH值，对糖化酶的作用都不利。
酒醅是在酸性环境下糖化发酵的，当酒醅的pH值在4.5以下，糖化酶则钝化失活，如继续变酸，则逐渐成为不能糖化发酵的死醅；反之，当用石灰水中和酸度至pH4.5以上，甚至呈强碱性时，糖化酶也将发生钝化，直至完全失去活性。通常酒醅在发酵过程中是逐步生酸的，所以掌握酒醅的入池酸度应在pH4.5以上。
在正常发酵生酸时，要逐步调整到pH4.5。由于各种有机酸的氢离子解离度不同，通常化验酒醅所测定的酸度，是以毫克当量/10克醅（以乙酸计）表示，而实际酒醅中的酸度来源是以乳酸为主，包括醋酸等多种有机酸的混合物。
更确切地说，化验酒醅的入池pH值，比化验酒醅的入池酸度更为有利。酒化酶是酒精发酵一类酶系列的总称，酵母在进行酒精发酵时，同样存在一个最适pH值的问题，酸度常常表现为对酵母的生长和发酵有极大的抑制作用。
在所有的挥发或不挥发的有机酸中，越是高级脂肪酸，对酵母的毒性越大。生产实践证明：酒醅或发酵醪的酸度越大，酒精发酵越不旺盛。
（三） 酶的浓度和底物浓度 酶与底物浓度的关系，一般来说，当酶的浓度较小，底物浓度大大高于酶，则酶的浓度与反应速度成正比；当底物浓度一定时，酶的浓度继续增加到一定值以后，其反应速度并不加快。由于上述关系，过大的增加用曲量是不能收到预期效果的。
实践证明，曲大、酵母大，会使发酵前火猛，升温高，生酸快，糖化和发酵作用过早停止；如用曲量太小，则发酵迟缓，酒醅不容易发透，材料干硬，对生产也是不利的。因此，制造白酒使用曲和酵母，必须根据质量，酌情使用，不要贪多。
白酒酿造有淀粉浓度大、升温高、酸度大、发酵周期长等特点，因此要求所采用的糖化酶及酒化酶等，应具有耐温、耐酸、耐酒精、酶活性作用持久等特性。一般固态或液态发酵的入池淀粉浓度为14—18%，求战清杂清茶清茬发酵淀粉浓度高达30%以上，因此，在发酵过程中要求糖化酶和酒化酶等具有一定的热稳定性。
糖化酶和酒化酶的热稳定性越好，醇活性越不容易受破坏，发酵作用也进行得越彻底。酒醅发酵要产生一定的酸度，而且酸度随温度升高而增加。
为了保持酶活性在酸性环境下不致钝化失活，要求糖化酶及酒化酶等具有较大的耐酸特性。一般黑曲霉的糖化酶，比黄曲霉的糖化酶耐酸性更好。
所以，近几年来，多以黑曲霉代替黄曲霉作糖化曲酿酒。另外，白酒发酵有较长的发酵周期，因此，要求酶的作用性质具有持久性。
对糖化酶要求有前糖化力和后糖化力，即要求有较高的总糖化力。对酒化酶，要求发酵均衡持久，这样，发酵才能有后劲。
6.抗体酶的论文
抗体酶研究的新进展 摘要催化抗体也叫抗体酶，是具有催化活性的免疫球蛋白。
由于它兼具抗体的高度选择 }生和酶的高效催化性，因而催化抗体制备技术的开发预示着可人为生产适应各种用途的，特别是 自然界不存在的高效催化剂，对生物学、化学和医学等多种学科有重要的理论意义和实用价值。关键词催化抗体抗体酶筛选酶学特征 抗体酶或催化抗体是一种新型人工酶制剂，它 是依据对酶分子催化反应机制的理解，结合免疫球 蛋白的分子识别特性，应用免疫学、细胞生物学、化 学和分子生物学等技术制备的具有高度底物专一性 及特殊催化活力的新型催化抗体。
抗体酶的多样 性、特异性和稳定性，已形成了生物界中一个崭新的 超分子体系，它把免疫学、酶学理论的发展和抗体在 医药及工业等领域的应用推向一个新水平。近年 来，对抗体酶的制备、催化反应特性及分子结构等已 进行了一些研究，下面介绍抗体酶的基本性质和研 究进展。
1抗体的结构 抗体和酶一样是大分子蛋白质，由2条相同的 轻链（约2500u）和2条相同的重链（约5000u）组 成（见图1）。轻链由VL（可变区）和CL（不变区）组成，重链 也由Ⅶ（可变区）和CH（不变区）组成。
重链和重链 及重链和轻链问通过二硫键相连。此外，重链还有 一 连接枢扭。
抗体的结合部位由6个超变区组成。对同类型抗体CL和CH部分氨基酸的序列相同，然 而·VL和VH是非常专一的。
可变区约由110个氨 基酸组成，至少可产生1亿个不同抗体，它是抗体多 样性的基础。抗原结合片断（Fab）由轻链和重链VH 及CH1组成。
抗体一抗原复合物是借助范得华力、疏水作用、静电作用及氢键作用而形成。 2抗体酶的基本结构及性质 抗体酶主要来自IgG抗体分子。
对抗体结构分 析表明：I分子是由2条相同的重链及2条相同的 轻链靠二硫键连接而成。木瓜蛋白酶作用抗体后，产生3个片断，其中相同的2个片断为Fab;Fab中 与抗原结合的部位，是高度可变区（Fv），该部位广泛 的结构及顺序变化决定了抗体对外来物质的识别特 性，其中电荷互补及立体互补是其分子识别的主要 特征。
3抗体酶的产生途径和方法 酶与其催化的活性化合物间具有结构互补的性 质，即酶分子与“反应过渡态”化合物互补，从分子识 别角度看，这种互补关系类似于抗体抗原间的互补 作用。抗体酶最初的产生手段是按以下步骤进行 的：首先，合成稳定的反应过渡态类似物，将此化合 物作为半抗原与载体蛋白相连，免疫动物制备单克 隆抗体，由它诱导产生的抗体，可按预定方向取得催 化活性。
该方法中最重要的是半抗原的分子设计和 合成。近年来，抗体酶的产生途径又有新的进展。
3.1直接引入天然或合成的催化基团1）化学诱变法。将合成或天然具有催化活性的 基团通过化学修饰法引人到抗体分子中。
2）蛋白质 工程技术。通过蛋白质工程技术使抗体结合部位的 氨基酸残基产生定向改变，既可直接产生酶活性，也 可对初步具有酶活性的抗体进行进一步改造，构建 高活性抗体。
3.2基因工程技术 由免疫学可知，对独特的分子抗原，动物可有5~1万个不同的B细胞产生抗体，而通过细胞融合 产生的单克隆抗体一般只有上百个。因此，重组抗 体分子在细菌E.coli中的表达，可提供抗体库。
基 因工程抗体库得到的抗体数量比免疫技术得到的抗 体要高几个数量级，但该方法中筛选抗体的技术还 需进一步完善。3.3相似分子诱导法 在反应过渡态类似物难以合成的条件下，采用 化学结构相似的分子如酶的抑制剂分子做半抗原，也可筛选到抗体酶。
免疫系统对一个半抗原可产生 一 些结构大致相同，但却存在细微差别的抗体，因此 用含有与半抗原类似结构的化合物筛选单克隆抗 体，也会找到所需要的有特殊识别功能及催化作用 的抗体酶。3.4共价抗原免疫法 这是在亲和标记抑制剂基础上发展起来的新抗 体酶制备方法。
如果以亲和标记剂为半抗原，则抗 体结合部位将产生与亲和基团电荷性质相反的基 团，如：亲核性和亲电性氨基酸、酸性氨基酸及碱性 氨基酸等。该途径适用于产生一些活性部位中含有 上述氨基酸的酶。
3.5细胞融合法 此方法是Schultz等首次使用的方法。其过程 如下：要得到一特定抗原的抗体，如果抗原是小分 子，必须将其和载体蛋白相联。
然后对此抗原进行 免疫，使宿主有机体针对抗原产生抗体，产生抗体的 脾细胞与骨髓细胞相融合。融合得到的杂交细胞既 能产生抗体又能在体外培养。
通过选择培养，杂交14饲料研究 细胞得以存留。将杂交体克隆化，即繁殖成母体的 同一细胞或分离成菌落。
这些菌落能产生单一均匀 的抗体。对这些菌落用酶联免疫吸收试验加以筛 选，以评价其选择性结合抗原的能力。
然后把抗原 结合到一种固体支撑物上，再加入含有抗体的介质，这样抗原一抗体复合物随即形成，经过提纯就得到 AB—AG复合物。4抗体酶的筛选方法 在制备抗体后，抗体酶的筛选是很重要的，常见 的筛选方法有：1)EHSA法。
用ELISA法筛选对半 抗原有亲和力的单克隆抗体，然后大量培养，分析单 克隆抗体的酶学活性；2）酶学活性检测法。直接用 反应底物检测细胞培养液中抗体的酶活性。
此法比 上述方法更简单，但需要抗体具有可观。
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